一、酶切连接在生物医疗领域中占有重要地位，选择适合的限制性内切酶至关重要。以下是选择内切酶时需考虑的几个方面：

1. 限制性内切酶的识别序列需在目标载体中存在且只能有一个，同时在目标片段中应无此序列；

2. 尽量选择产生粘性末端且具高酶切效率的限制性内切酶，例如BamHI和HindIII；

3. 在双酶切时，要注意缓冲液对两种内切酶活性的影响，可根据具体活性调整酶量与反应时间。如缓冲液不能满足两者要求，建议分步酶切；

4. 对于单酶切，建议进行去磷酸化，以减少载体自环化的可能性。特别是当酶切后产物末端互补或为平端时（由于末端的磷酸基团和羟基基团可能形成酯键而导致自连），去磷酸化操作显得尤为必要。在此过程中，碱性磷酸酶可有效去除载体5’末端的磷酸基团。

二、引物设计与PCR扩增：

1. 完成目标片段的引物设计后，需根据载体线性化使用的内切酶在上下游引物的5'端引入相应的酶切位点及保护碱基；

2. 建议选用高保真酶进行目标片段的PCR扩增，并优化退火温度、反应体系及程序。

三、PCR/酶切产物的纯化回收：

1. 完成PCR/酶切反应后，需通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，确认是否存在目标大小的条带；

2. 推荐采用切胶回收的方式进行纯化（切胶时间建议控制在3分钟以内，以避免紫外线对DNA的损伤），并使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，同时通过跑胶确认目标条带的存在；

3. 若回收浓度较低，可通过增加PCR/酶切反应体系，采取多管反应单管回收的方法，提升回收产物浓度；

4. PCR产物应在切胶回收完成后，再进行酶切反应和后续的纯化回收。

四、目的片段与载体的连接：

利用T4 DNA连接酶完成酶切后载体与片段的连接重组，具体步骤如下：

1. 连接体系中使用的线性化载体与目标片段摩尔比可调整为1:1至1:10，通常最佳比例为1:3；

2. 在连接平末端载体与DNA片段时，首先需对载体进行去磷酸化，以减少其自环化的可能性；

3. 连接体系各组分投入体积应≥1μl，若浓度过高可适当稀释后使用。

五、感受态转化及涂板：

1. 推荐使用克隆用化学感受态细胞进行连接产物的转化，不建议使用表达用细胞；

注：DH5α和Fast-T1适合≤15kb质粒的转化，而XL10适合10kb质粒的转化；

2. 重组产物体积与感受态细胞体积的比例为1:10，建议将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或者将5μl重组产物加入至50μl感受态细胞；

3. 热激时间应按照感受态细胞说明书操作；

4. 平板上的抗生素抗性需要与转化的载体抗性保持一致；

5. 涂板时菌液需先进行离心（2500×g，3min），吸取丢弃多余的LB培养基，保留100μl重悬后全部涂板，或根据需要吸取适量进行涂板。

六、单克隆菌落PCR鉴定：

1. 挑取大小适中的单克隆菌落进行鉴定，避免选择过大或过小的菌落；

2. 挑取若干单克隆菌落进行进一步鉴定分析；

3. 将挑取的菌落放入添加了10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中溶解均匀后，吸取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）的模板；

4. 推荐使用一对分别位于片段和载体上下游的引物进行PCR鉴定。

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