团队首先利用染色质相关蛋白纯化与高分辨质谱分析的方法，筛选出HSF5作为生精细胞染色质相关蛋白。通过荧光共定位技术，进一步明确了HSF5在生精细胞中的特异性核定位模式，其表达始于早/中期粗线期精母细胞，并持续到约圆形精子（step 4）时消失，这表明HSF5在减数分裂过程中可能发挥重要作用。

研究团队通过CRISPR-Cas9技术建立了Hsf5基因敲除（Hsf5KO）小鼠模型。观察到Hsf5KO成年小鼠呈现雄性不育，进一步的睾丸组织形态学分析发现，Hsf5KO小鼠的附睾精子缺失，睾丸管腔内圆形精子和长形精子均匮乏，并伴随大量生精细胞凋亡现象。染色体铺展实验进一步证实，Hsf5KO小鼠的精子发生停滞在中晚期pachynema阶段，并且在这些精母细胞内并未观察到DNA双链断裂（DSB）修复、联会重组及减数分裂性染色体沉默（MSCI）等生物事件的明显异常。这些结果提示HSF5可能参与调整粗线期进程后期的生物学事件，而非在粗线期的早期过程如DSB修复、联会重组及MSCI中发挥关键作用。

为了深入研究HSF5基因在粗线期中晚期过程中的作用，研究团队利用单细胞测序（scRNA-seq）和Cleavage Under Target & Tagmentation (CUT&Tag) 测序方法进行了多组学联合分析。单细胞测序结果显示，Hsf5KO精母细胞停滞在“pachytene-like（P-like）”状态，P-like精母细胞的转录谱与野生型小鼠粗线期精母细胞相比显著异常，尤其是粗线期细胞检查点（pachytene checkpoint）基因如Wee1、Dmc1和Msh5等出现异常高表达，这可能是导致精母细胞凋亡的原因。

结合CUT&Tag数据，研究发现HSF5直接靶向调控的基因如Sycp1、Meiob和Msh4等也表现出异常高表达。然而，通过RNA转录动力学分析显示，野生型小鼠粗线期精母细胞在早期到晚期的过程中，Sycp1、Meiob、Msh4的转录量逐渐降低，而Hsf5KO小鼠则保持持续高水平的转录，未表现出下降趋势。此外，有证据表明HSF5可能与染色质重构复合体蛋白如SMARCA5、SMARCA4及SMARCE1相互作用，调控Sycp1、Meiob、Msh4等基因的表达，确保pachynema过程顺利完成，为后续的减数分裂解联会阶段做好准备。

总体而言，该研究揭示了HSF5在精母细胞减数分裂pachynema过程中的调控机制以及与雄性不育之间的新的分子联系。在减数分裂过程中，HSF5与SMARCA5、SMARCA4、SMARCE1相互作用，抑制部分基因（如sycp1、Meiob、Msh4和Hat1）的表达；在pachynema过程的后期，HSF5则直接或间接促进Hspa2、Ccnb1、Plk1等基因的表达。由此，HSF5所介导的基因调控确保了精母细胞减数分裂pachynema过程的顺利进行，并为后续的解联会做了充分的准备。

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