以下是细胞培养与荧光标记的操作步骤：

步骤一：细胞洗涤

在培养板内，用PBS对已经爬好细胞的玻片进行三次浸洗，每次持续3分钟。

步骤二：固定细胞

使用4%的多聚甲醛进行细胞固定，固定时间为15分钟。随后，用PBS对玻片进行三次浸洗，每次3分钟。

步骤三：透化处理

使用0.5%的Triton X-100（用PBS配制）在室温下处理20分钟（若抗原在细胞膜上表达，此步骤可省略）。

步骤四：血清封闭

用PBS对玻片进行三次浸洗，每次3分钟，随后用吸水纸吸干多余PBS。在玻片上滴加正常山羊血清（前提是二抗来源为山羊），在室温下封闭30分钟。

步骤五：加入一抗

用吸水纸吸走封闭液，但不进行洗涤。每片玻片上滴加足量稀释的一抗，并放入湿盒中，4°C孵育过夜。

步骤六：加入荧光二抗

用PBST对爬片进行三次浸洗，每次3分钟，吸水纸吸干多余液体后，滴加稀释好的荧光二抗。在湿盒中于20-37°C孵育1小时，并用PBST进行三次洗涤。

注意： 从加入荧光二抗开始，后续所有操作尽量在较暗的环境下进行。

步骤七：再次进行血清封闭

用吸水纸吸干液体，再次在玻片上滴加正常山羊血清，室温下封闭30分钟。

步骤八：添加第二种一抗

用吸水纸吸掉封闭液而不进行洗涤，然后滴加稀释好的第二种一抗，并于4°C的湿盒中避光孵育过夜。注意：第二种一抗的来源物种需与第一种不同，例如：小鼠和兔。

步骤九：加入第二种荧光二抗

用PBST对爬片进行三次洗涤，每次3分钟后，吸干多余液体，滴加稀释好的荧光二抗，在湿盒中于20-37°C孵育1小时，再次用PBST进行三次洗涤。

注意：如果第一种抗体使用红色荧光，第二种须选择不同颜色的荧光。

步骤十：复染细胞核

加入DAPI进行避光孵育5分钟，以染核，然后用PBST洗涤四次，每次5分钟，以去除多余的DAPI。

步骤十一：观察和成像

用吸水纸吸干爬片上的液体，使用含抗荧光淬灭剂的封片液进行封片，最后用荧光显微镜观察并采集图像。

细胞爬片规格和处理信息

品名及规格如下：

• J060016：24mm圆形细胞爬片，处理：伽马射线，100片/盒，10盒/箱
• J120011：20mm圆形细胞爬片，处理：伽马射线，100片/盒，10盒/箱
• J240012：14mm圆形细胞爬片，处理：伽马射线，100片/盒，10盒/箱
• J480014：8mm圆形细胞爬片，处理：伽马射线，100片/盒，10盒/箱
• J960019：3mm圆形细胞爬片，处理：伽马射线，100片/盒，10盒/箱
• J060036：24*24mm方形细胞爬片，处理：伽马射线，100片/盒，10盒/箱
• J120031：14*14mm方形细胞爬片，处理：伽马射线，100片/盒，10盒/箱
• J240032：10*10mm方形细胞爬片，处理：伽马射线，100片/盒，10盒/箱
• J060026：24mm圆形细胞爬片，包被：多聚赖氨酸，处理：伽马射线，20片/盒，10盒/箱
• J120021：20mm圆形细胞爬片，包被：多聚赖氨酸，处理：伽马射线，20片/盒，10盒/箱
• J240022：14mm圆形细胞爬片，包被：多聚赖氨酸，处理：伽马射线，20片/盒，10盒/箱

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