ELISA是酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的简称，它是一种在免疫荧光和放射免疫技术之后发展的免疫酶技术。成功的ELISA方法研发的关键在于选择和搭配实验中使用的试剂与耗材。对试剂和耗材特性及多样性的理解，有助于根据不同的实验需求寻找合适的组合，从而开发出高质量的ELISA方法。

一、酶标板材

市场上的酶标板通常为聚苯乙烯（C8H8）n类型。产品线比较丰富的公司会针对不同特性的化学修饰，提供不同性能的酶标板。一般说明书会根据高结合力和中结合力进行分类。然而，依据多年从业经验，笔者更倾向于将酶标板材分为亲水、弱亲水、未处理和疏水四个等级。通常来说，随着板材从亲水到疏水，蛋白的结合能力由强变弱，这会导致以下几个影响：相同浓度的蛋白包被时，结合能力强的材料在酶标板上固定的蛋白更多。例如，亲水板材的最大吸附抗体量为220ng，而疏水板材则只有100ng。在从亲水到疏水的过程中，板材对包被蛋白的吸附效率提升，但同时也增加了对非特异性吸附的能力，从而可能产生非特异性信号。因此，一个专注于多样化ELISA方法开发的实验室，应该准备多种不同特性的酶标板材供选择。

二、包被液

常用的包被液为PBS（pH 7.4）或碳酸钠-碳酸氢钠溶液（pH 9.6）。pH和离子浓度会对包被效率产生一定影响，研究应根据包被蛋白的特性进行分析。包被完成后，大部分蛋白仍留在溶液中。文献中提到，蛋白溶于包被液后，通过抽真空使其以更高密度吸附在酶标板上，或许可以提高包被效率。

三、封闭剂

常用的封闭剂包括3% BSA（w/v）和5%脱脂奶粉（w/v）等。封闭液的作用是覆盖酶标板上包被蛋白以外的空间，从而抵抗后续样品或样品中其他物质与酶联抗体的非特异性吸附。根据笔者的经验，封闭剂对成分简单的样品溶液效果较好，但对于复杂样品时则大打折扣。有研究表明，封闭剂的封闭效果与分子大小成反比，因而使用分子量较小的封闭剂（如酪蛋白）可能会取得更好的封闭效果。特别提醒：如果检测体系中使用生物素-链霉亲和素体系，切勿采用脱脂奶粉作为封闭剂，因为其含有会干扰检测体系的生物素。

四、洗涤液/稀释液

常用洗涤液为中性缓冲液加适当浓度的去污剂，如PBST（0.05%（V/V）Tween-20 in PBS）。稀释液中通常会加入一些封闭剂成分，如0.5% BSA（w/v） in PBST。在体内样品检测中，稀释液中也常加入一定浓度的阴性血清，以保证不同稀释度样品在非特异性背景上的一致性。

五、酶联抗体

酶联抗体种类繁多，根据作用位点可分为特异性酶联抗体和通用型酶联抗体。特异性酶联抗体针对特定蛋白的表位，而通用型酶联抗体则针对多肽序列组成的标签、生物素或特定物种抗体的Fc端保守区域等。常用的标记酶有AP（碱性磷酸酶）和HRP（辣根过氧化氢酶）。酶联抗体根据成分可分为单抗和多抗酶联抗体，其中多抗一般通过免疫兔或山羊获得，需特别注意与ELISA体系中其他试剂的交叉反应。根据其分子量，酶联抗体分为全长、Fab片段和scFv类型。较小分子量的酶联抗体降低了和样品蛋白结合时存在的空间阻碍，但也增加了和酶标板材非特异结合的风险。

六、显色液及酶标仪

显色液的选择需与酶联抗体的酶类型匹配，并且要适配实验室所用的酶标仪。例如，如果酶联抗体偶联的是HRP，则可以使用TMB显色液，利用能够进行吸光度读数的酶标仪进行检测；也可以使用Ampliflu™ Red作为底物，进行荧光读数；或采用QuantaRed ADHP作为底物，进行化学发光读数。总体而言，ELISA方法的灵敏度会受到底物检测方法的限制，化学发光底物的信号下限优于荧光底物，再优于吸光度值底物。即使是常用的TMB显色液，市场上也有不同显色强度的产品，需根据具体实验情况进行合理选择。

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