在生物医疗研究中，无论是在体外难以感染的细胞中构建慢病毒文库，还是在体内进行AAV文库实验，确定最佳剂量以确保每个靶点只进入到一個细胞，始终是科研工作者面临的一大困惑。文库实验旨在找到由单个基因引发的功能变化，因此必须控制每个细胞只被携带一个靶点的病毒感染。

在细胞实验中，文库筛选建议首先使用对照病毒进行预实验，以探索最佳的感染复数（MOI），这一MOI在感染效率达到80%时显得尤为重要。在文库操作中，设定的MOI为最佳MOI的三分之一，目的是通过大幅度减少病毒量来控制单个细胞内的病毒数量，从而降低重复感染的几率。然而，对于一些难以感染的细胞类型，如免疫细胞，以及体内实验，确定最佳剂量的难度更大，因为最佳MOI可能导致30%的感染效率，如果按照三分之一的剂量，几乎无法获得有效感染的细胞。

为了解决这个问题，尊龙凯时推出了三色荧光病毒（mTagBFP、Venus、mCherry），这对研究人员优化文库感染预实验提供了帮助。该三色荧光病毒涵盖了慢病毒和AAV两种产品类型。相关文献《Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq》提供了三色荧光病毒的实验方法，以探索AAV文库在体内的最佳剂量。研究者通过体内滴定实验，制备了三种不同剂量的AAV：25E9、5E9和5E10颗粒数，血清型为phpb，病毒构建方案是在CBh启动子的控制下独立表达三种荧光蛋白。

流式细胞筛选的方法能够帮助确定一个较低剂量下双病毒感染同一细胞的概率，从而确定最佳剂量。最终，选择了5E9的剂量，因为它能够最大化单个AAV感染的细胞总数。

三色实验的设计是将三种AAV的等比例混合物注射到不同剂量的LSL-Cas9动物中。分别为低剂量（25E9）、中剂量（50E9）和高剂量（25E10）。实验结果显示，左图显示了不同病毒剂量注射后，感染细胞核（即至少表达一种荧光蛋白的细胞核）的百分比；右图则表示了表达1个、2个或3个荧光蛋白的感染细胞核的百分比。

无论是在细胞实验还是动物实验中，研究人员均可使用三色荧光病毒进行相关的预实验。在不同剂量梯度下进行细胞感染（参考慢病毒感染操作手册）或进行小鼠的体内注射（参考动物注射文献），通过流式细胞分析转染效率和单荧光细胞比例，从中找出单病毒感染比例（即单色荧光细胞数量）最高且感染细胞数量较多的剂量作为最终的最佳剂量，并以此作为文库实际实验的标准剂量。

参考文献：Santinha, AJ, Klingler, E, Kuhn, M et al. Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq. Nature, 622, 367–375 (2023).