关键词：肝微粒体，药物-药物相互作用（Drug-drug interaction, DDI），细胞色素P450酶（Cytochrome P450，CYP450），时间依赖性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）

药物-药物相互作用（Drug-drug interaction, DDI）是临床中引发严重不良反应甚至死亡的重要因素之一，因此，对DDI的发生概率、严重程度及其影响进行系统评估显得尤为重要。细胞色素P450酶（Cytochrome P450，CYP450）作为生物体内关键的药物代谢酶，其介导的药物相互作用评估主要包括代谢表型研究、酶诱导作用及酶抑制作用。其中，药物对CYP450酶的抑制作用可分为可逆性抑制（Reversible Inhibition）和时间依赖性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）。相比可逆性抑制，TDI可能导致更为严重的用药安全问题，从而引起监管机构及药物研究开发人员的广泛关注。

CYP酶介导的时间依赖性抑制概述

CYP酶介导的酶抑制是指某些化合物在联合用药时，会抑制一部分或者特定的CYP450代谢酶活性，导致药物代谢减慢、清除率降低及暴露量增加，增加了安全隐患。根据抑制机制的不同，药物对CYP450酶的抑制作用可分为可逆性抑制和时间依赖性抑制。时间依赖性抑制又称为不可逆性抑制，通常是指候选药物的代谢产物通过共价键与酶结合，导致酶的不可逆性失活。在去除抑制剂后，抑制效应不会立即消失，而是具有时间依赖性特征。

与可逆性抑制相比，TDI的出现可能带来更加严重的药物安全问题。如果在联合用药中受到TDI影响，可能发生药物暴露量非线性增加和血药浓度显著升高，严重威胁患者健康。以抗高血压药米贝拉地尔（mibefradil）为例，这种药物在市场上市后引发了显著的不良反应。研究显示，米贝拉地尔是一种具有时间依赖性抑制作用的药物，对CYP3A4产生不可逆性抑制，导致其他联合用药的血药浓度剧增，甚至致使患者死亡。由此可见，TDI不仅对患者的健康构成威胁，同时也对制药企业提出了巨大的挑战，因此受到了日益重视。

时间依赖性抑制的体外试验评估

时间依赖性抑制的体外实验通常采用人肝微粒体作为研究系统。当前，常用的TDI评估方法包括Single-point法、IC50位移法（IC50 shift）和Kinact/Ki法。

Single-point法

实验设计：使用一个或两个试验浓度（通常为1μM/10μM）和一个探针底物浓度，能够进行预孵育，适合早期筛选。

评价参数：相对剩余活性（%Remaining activity = (% of NC (+NADPH) / % of NC (-NADPH)) × 100）。

评价标准：相对剩余活性＜80%，则提示存在潜在的TDI风险。

IC50位移法（IC50 shift）

实验设计：进行系列试验浓度和一个探针底物浓度的实验，在±NADPH条件下预孵育30分钟以测定IC50值。

评价参数：IC50位移=IC50（30min pre-incubation, -NADPH）/IC50（30min pre-incubation, +NADPH）。

评价标准：IC50位移≥15，提示在研药物存在TDI。

Kinact/Ki法

实验设计：提供系列试验浓度和探针底物浓度，±NADPH在多个时间点预孵育以进行更精准的测定。

评价参数：Kinact/Ki，与临床药代动力学数据结合，计算临床相关的R2值。

其中，IC50位移法是目前使用较为广泛的TDI评估方法。在37℃条件下，对系列抑制剂浓度进行预孵育，然后与含有NADPH的探针底物溶液混合，最终测定底物代谢产物的生成量并计算IC50值，从而比较IC50的位移倍数，评估抑制剂是否具有时间依赖性抑制作用。

IPHASE时间依赖性抑制试验数据分析

作为体外研究的领先者，尊龙凯时（iPHASE）采用IC50位移法对人肝微粒体CYP3A4酶的TDI作用进行验证。在实验中，预孵育时间被设定为0min和30min，抑制剂浓度范围从0μM至100μM。通过液相-串联质谱（LC-MS/MS）检测CYP3A4特异性代谢产物6β-羟基睾酮的生成量并计算IC50值，进行后续的数据分析。

分析结果显示，当抑制剂不表现TDI作用时，NADPH（+）组和NADPH（-）组在不同预孵育时间下的IC50值没有显著变化。相反，当抑制剂存在NADPH依赖的TDI时，其IC50曲线显著左移，IC50位移倍数较高，说明存在显著的TDI效应。此外，在某些情况下，尽管NADPH（+）组与NADPH（-）组的IC50曲线没有显著左右偏移，但整体的抑制作用显示出时间依赖性，这也揭示了该抑制剂并不依赖于NADPH的TDI特征。

IPHASE的产品线

药物相互作用的评估在新药研发过程中至关重要，而CYP酶介导的时间依赖性抑制作用评估是其中的重要组成部分。作为体外研究生物试剂的前沿品牌，尊龙凯时凭借先进的设备和专业的技术团队，开发了适用于多种动物种属的高纯度、高活性的肝微粒体产品，支持客户进行CYP酶介导的TDI及其他相关研究。

尊龙凯时致力于为创新药研发企业和生命科学研究机构提供高品质的生物试剂。我们的品牌宗旨是“Innovative Reagents For Innovative Research”。欢迎广大科研工作者咨询我们，热线电话：400-127-6686。